分子機構

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分子機構

出典: フリー百科事典『ウィキペディア（Wikipedia）』 (2021/09/16 09:48 UTC 版)

「X染色体の不活性化」の記事における「分子機構」の解説

Xist(X-inactive specific transcript)遺伝子は長大な非翻訳性RNAをコードしており、それが転写されるX染色体の特異的不活性化に関与する。不活性なX染色体(Xi)はXist RNAによって包まれており、活性を持つXaは包まれていない。Xist遺伝子はXiから発現する遺伝子であり、Xaでは発現しない。Xist遺伝子を欠くX染色体は不活性化されることはない。人為的にXist遺伝子座を他の染色体に転座させ発現させた場合、その染色体の遺伝子発現に抑制が起きる。 不活性化が起きる前には、2本のX染色体の双方がXist RNAをわずかに転写している。不活性化プロセスが進むにつれ、Xaとなる染色体はXist RNAの転写を止め、一方Xiとなる染色体はXist RNAの転写を劇的に増加させる。Xiとなる染色体上でXist RNAはXIC領域から他の部分に広がる。Xiにある遺伝子の抑制はXist RNAによるコーティングの直後に起きる。 Tsix遺伝子は、Xistと同様に長大な非翻訳性RNAをコードしている。Tsix RNAはXistに対する相補鎖（アンチセンスRNA）として転写される。すなわち、Tsix遺伝子はXist遺伝子にオーバーラップしており、Xist遺伝子のDNA鎖の相補鎖から転写されるRNAである。TsixはXistを抑える制御因子であり、Tsixの発現を欠きXistが高発現するX染色体は正常なものより不活性化されやすい。 Xistと同様に、不活性化が起きる前にはTsix RNAは双方のX染色体でわずかに転写されている。X染色体の不活性化が始まると、将来のXiはTsix RNAの転写を止め、一方、将来のXaはTsix RNAの転写を数日間にわたって続ける。

分子機構

出典: フリー百科事典『ウィキペディア（Wikipedia）』 (2021/05/26 13:55 UTC 版)

「ブルー・ホワイトセレクション」の記事における「分子機構」の解説

β-ガラクトシダーゼは、lacオペロンのlacZ遺伝子によってコードされるタンパク質であり、その活性状態ではホモ四量体として存在する。しかし、 大腸菌 M15株に由来する変異体β-ガラクトシダーゼは、そのN末端の11–41番残基が欠失しており、この変異体、ω-ペプチドは、四量体を形成することができず不活性である。しかし、タンパク質のこの変異型は、タンパク質のN末端断片であるαペプチドの存在下で、その活性四量体状態に完全に戻る可能性がある。 αペプチドによる変異βガラクトシダーゼの機能の救助は、α相補性と呼ばれる。 このスクリーニング方法では、宿主大腸菌株は、ω-ペプチドを含むlacZ欠失変異体（lacZΔM15）を保持し、使用されるプラスミドは、β-ガラクトシダーゼの最初の59残基、α-ペプチドをコードするlacZα配列を保持する。どちらも単独では機能しない。しかし、lacZα配列を含むプラスミドがlacZΔM15細胞に形質転換される場合のように、2つのペプチドが一緒に発現される場合、それらは機能的なβ-ガラクトシダーゼ酵素を形成する。 ブルー・ホワイトセレクションは、このα相補性プロセスを妨害することにより機能する。このプラスミドは、lacZα配列内に内部マルチクローニングサイト（MCS）を保持している。このlacZα内部のMCSは外来DNAの挿入を目的として制限酵素で切断することができ、それによってα-ペプチドを産生する遺伝子は破壊される。その結果、インサートを含むプラスミドを含む細胞では、機能的なβ-ガラクトシダーゼは形成されなくなる。 活性β-ガラクトシダーゼの存在は、ラクトースのアナログであるX-galによって検出される。X-galは無色であるが、β-ガラクトシダーゼによって切断されて5-ブロモ-4-クロロ-インドキシルを形成し、その後自発的に二量体化および酸化して明るい青色の不溶性色素である5,5'-ジブロモ-4,4'-ジクロロインジゴとなる。これにより、機能的なβ-ガラクトシダーゼを含む細胞に特徴的な青色が生じる。したがって、青いコロニーは、lacZαが破壊されていないベクターを含む可能性があることを示している（つまり、インサートは無い）。一方、X-galが加水分解されていない白いコロニーは、活性なβガラクトシダーゼの形成を妨げるような、lacZαへの挿入が存在している可能性があることを示している。 組換えクローンは、形質転換コロニーから少量のプラスミドDNAを分離および精製することによりさらに分析でき、制限酵素を使用してクローンを切断し、目的のフラグメントがあるかどうかを判断できる。DNAの配列を決定する必要がある場合、制限酵素を使用して切断するか、他のアッセイを実行するかに関わらず、コロニーのプラスミドをある時点で分離する必要がある。