PCRとは?

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PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)

PCRがかからない場合に

PCRに必要な要素

PCRの操作は簡単ですが、反応は多段階・多基質の複雑な反応です。酵素基質適切な濃度純度存在していることは大切です。

ポリメラーゼTaqPfuなど。これが無けれ無反応
鋳型DNA純度大丈夫?
dNTP材料無けれポリメラーゼ仕事がありません。
forwardプライマー一応、ストック濃度確認を。
reverseプライマーfwd同様、濃度確認
注文するときの向き5'-位置)は大丈夫でしたか?

その他のチェック

ダイマーチェック

自己ダイマーループ形成、fwd/revペアダイマー形成が起きないかどうか市販のソフトなどでチェックします。

プライミング部分の安定性

PCRで用いるポリメラーゼは、プライマーの3'末端酵素/DNA複合体形成し、鎖延長をはじめます(プライミング)。3'末端安定性上げるために3'末端GCペアであることが好ましいと言われています。

マルチクローニングサイト

プライマー回文配列の多い部分幅広くカバーしていると、プライマーダイマー形成可能性が高くなります。どうしてもダイマーが増えてしまう場合は、わざとプライマー濃度下げるのも手です。

プライマーダイマー

PCR反応でのプライマー鋳型DNA比べ高濃度存在するため、配列によってはプライマー同士アニーリングしてしまいます。安定二本鎖DNAプライマーダイマー)が形成してしまうと、そのDNA断片だけが指数関数的増幅されてしまい、目的DNA断片が得られません。

分子間ダイマー形成

分子内ヘアピンループ形成

PCR

この場合目的のPCR反応関与できないまた、配列によってはポリメラーゼが3'末端相補ヌクレオチド繋げてしまい、ループ構造がさらに安定化してしまう。

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PCR

【英】: Polymerase Chain Reaction
ポリメラーゼ連鎖反応複製連鎖反応ともいわれる

DNA特定部位をはさむ2種類のDNA断片プライマー)とDNA合成する酵素DNAポリメラーゼ)によるDNA鎖の合成反応。この反応繰り返しにより、DNA特定部位数十万倍程度まで増幅させることができる。

また、DNA合成のプロセスには、時間数分しかかからないことから、このPCR法利用が急速に広まった。PCR法遺伝子配列決定遺伝子定量など、遺伝子研究基本技術として確立されている。近年では、クラミジアHIV結核菌などの診断として応用されている。
ポリメラーゼ連鎖反応複製連鎖反応ともいわれる

DNA特定部位をはさむ2種類のDNA断片プライマー)とDNA合成する酵素DNAポリメラーゼ)によるDNA鎖の合成反応。この反応繰り返しにより、DNA特定部位数十万倍程度まで増幅させることができる。

また、DNA合成のプロセスには、時間数分しかかからないことから、このPCR法利用が急速に広まった。PCR法遺伝子配列決定遺伝子定量など、遺伝子研究基本技術として確立されている。近年では、クラミジアHIV結核菌などの診断として応用されている。
PCR
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デオキシリボ核酸

プライマー

遺伝子


PCR

PCR(polymerase chain reactionポリメラーゼ連鎖反応)法は、DNA配列断片大量増幅する分子生物学の手法です。鋳型となるDNADNA合成の起点となるプライマーDNA材料となるヌクレオチドDNA合成酵素などをチューブ内に入れ、94DNAを1本鎖に熱変性させる)→55プライマーDNA対合させる)→72DNA合成する)といった3段階温度変化周期的に行わせるだけで、2本のプライマーにはさまれたDNA断片短時間でおよそ10万倍に増幅できます1988年Mullisは、PCR反応温泉から分離された好熱菌由来DNA合成酵素を用いる方法確立し、1993年ノーベル化学賞受賞しています。現在では、DNA診断DNAクローニング細菌ウイルスの検出さまざまな生物ゲノム決定などの幅広い分野利用されています。PCR法発見がなかったら現在のバイオ発展はもっと緩慢なものになっていたでしょう


PCR法

PCR, Polymerase chain reaction

【概要】 ノーベル賞をとった核酸増幅法一つ最初に検体からDNA抽出する。これをDNA分解酵素断片化したあと、高温にして1本鎖にし、次に目的遺伝子特有のプローブ(短い遺伝子)と塩基加えDNAポリメラーゼ反応させる。そうすると相補性DNA鎖が合成され2本鎖の割り箸のようなDNAができる。試験管高温にすると割り箸割れるようにDNAは1本鎖に別れる温度下げるとまたプローブとの反応が進む。これを繰り返すと1本の遺伝子断片が、2本、4本、8本、16本、、と倍々で増えて行く。数十繰り返すと、元の遺伝子数十万倍増える。あらかじめ量がわかった遺伝子を入れて並行して反応させれば、測定検体比較して定量できる。 

問題点感度の高さが逆に弱点になる。つまり実験環境から間違った遺伝子潜り込むことがある。また拾い上げるべき遺伝子配列(プライマー)の設計ポイントになる。目的遺伝子変異激し場合は、複数プライマー組み合わせ見逃し避けなければならない。 

応用ロシュ社ではクラミジアトラコマチス淋菌結核菌、Mアビウム、Mイントラセルラーの診断キット市販しており、ウイルスではHBVHCVHIV-1定量測定キット市販している。HIV感染症における応用としては、(1)HIV抗体ができる前の、急性HIV感染症の診断、(2)感染母体からの移行抗体をもつ胎児新生児HIV感染の診断がある。細胞からDNA抽出する場合プロウイルス検出できる。

《参照》 HIV抗体サイレントインフェクションHIVRNART-PCR法結核


PCR法

極めて微量遺伝子DNA)を含む溶液の中から自分の望む特定のDNA領域数百から数千塩基対)を短時間効率的大量増やすことのできる技術です。原 理は、生体細胞の中で起きている酵素反応です。細胞分裂の際にDNA複製されるときには二本鎖のらせん構造取っているDNAがほどけて1本ずつになり、それぞれの鎖を鋳型にしてペアになるDNA酵素合成されますが、PCRはこのようなDNA複製反応試験官の中で繰り返し行う方法です(1時間程度反応で1千万倍にまで増やすことも可能です)。

PCR

出典: フリー百科事典『ウィキペディア(Wikipedia)』 (2011/12/15 16:59 UTC 版)

PCR






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