プラスミド抽出

分子生物学用語集

プラスミド抽出

大腸菌などの菌体を溶解し、プラスミドDNAを抽出する方法で、精製度は高くないが操作が簡便な抽出方法である。プラスミドや菌株にもよるが、培養液数1-2mLで数百ナノグラムスケールのプラスミドDNAが得られる。

1. プレートからコロニーを拾って、液体培地で一晩培養
2. 培養液をチューブに移して遠心して回収。(1min at 4°C 15,000rpm)
3. 0.2mLのSolIを加え、ボルテックスで分散。
4. 0.4mLのSolIIを加え、軽く浸透して氷上でインキュベート。
   （5minくらいたっても透明～半透明の溶液にならない場合は菌体量が多すぎる）
5. 0.3mLのSolIIIで中和する。ここでDNAは溶解したままアルカリ性で溶けていた分子（タンパク質など）が凝集する。
6. 遠心で不溶物を沈殿させる。（15min at 4°C 150,000rpm）
7. 上清を新しいチューブに移してRNaseAを2 μL添加して37°C 20minインキュベート。
8. フェノール・クロロホルム抽出
9. イソプロパノール沈殿
10. エタノール沈殿

溶液調製

SolI

組成	量	目的
1M Tris-HClバッファー(pH8.0)	5 mL
0.5M EDTA	4 mL	DNase活性の抑制

H₂Oで200mLにメスアップ。

グルコースは特に必要ない。細胞壁のペプチドグリカンを分解するためにリゾチームを添加したり、RNAを分解するためにRNaseを添加することもある。（酵素を加えない場合、単に菌体を洗って分散するためのバッファーと考えてよいでしょう）

SolII

組成	量	目的
NaOH	1.6g	脂質の可溶化、タンパク質の変性・可溶化、RNAの塩基触媒的加水分解
SDS	2g	脂質の可溶化、タンパク質の変性・可溶化

H₂Oで200mLにメスアップ。プラスチックボトルに保存。

SolIII

組成	量	目的
酢酸カリウム	58.9g	SolIのアルカリを中和
酢酸	24mL	SolIのアルカリを中和
H2O	106mL

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